Diosmina jako nowa nadzieja w walce z wirusem grypy typu A

Jak oceniać pandemię grypy i ograniczenia terapii?

Wirus grypy typu A (IAV) stanowi najczęstszy szczep wirusa grypy infekujący ludzi i zwierzęta, charakteryzujący się największym potencjałem wywoływania globalnych pandemii. Pandemia grypy z lat 1918-1919 spowodowała około 50-100 milionów zgonów na całym świecie, a kolejne pandemie wywołane przez nowe podtypy IAV w latach 1957-1958, 1968-1969 i 2009-2010 skutkowały odpowiednio 1-4 milionami, 1-4 milionami i 100 000-400 000 zgonów. Badania sugerują, że każdego roku na świecie występuje 3-5 milionów poważnych przypadków sezonowej grypy, prowadzących do szacowanych 290 000-650 000 zgonów rocznie. Podtyp H1N1 odpowiada za wybuchy pandemii i epidemii sezonowych, stanowiąc ciągłe zagrożenie dla zdrowia publicznego. IAV jest wirusem otoczkowym, jednoniciowym, o ujemnej polarności RNA z rodziny Orthomyxoviridae. Genom IAV składa się z ośmiu segmentów RNA kodujących 11 białek wirusowych: hemaglutyninę (HA), neuraminidazę (NA), dwa białka macierzy (M1 i M2), polimerazy RNA (PA, PB1, PB2 i PB-F2), nukleoproteiny (NP) oraz dwa białka niestrukturalne (NS1 i NS2). Każde pojedyncze białko IAV jest niezbędne do replikacji wirusa, dlatego strategie przeciwwirusowe ukierunkowane są na te białka w celu zmniejszenia wpływu infekcji IAV.

Dostępne leki przeciwgrypowe, takie jak amantadyna, rymantadyna, oseltamiwir, zanamiwir, peramiwir i laninamiwir, napotykają na problemy związane z rozwojem oporności wirusów oraz działaniami niepożądanymi. Nawet najnowszy lek zatwierdzony przez FDA, baloksawir marboxil (BAM), spotyka się z wyzwaniami w praktyce klinicznej ze względu na wyższy koszt w porównaniu do oseltamiwiru oraz pojawiające się dowody na rozwój oporności w Japonii. Dlatego poszukiwanie bezpiecznych i skutecznych kandydatów przeciwwirusowych przeciwko IAV pozostaje pilnym priorytetem.

Czy flawonoidy mogą zrewolucjonizować leczenie grypy?

Flawonoidy, które są naturalnymi produktami pochodzenia roślinnego, posiadają silne właściwości przeciwwirusowe. W szczególności apigenina, bajkaleina, katechina, kemferol, luteolina i kwercetyna należą do flawonoidów, które wykazują działanie przeciwwirusowe wobec IAV. Diosmina, glikozyd flawonowy występujący w owocach cytrusowych, wykazała silne działanie przeciwwirusowe przeciwko rotawirusom. Ten efekt przeciwwirusowy jest prawdopodobnie związany ze specyficzną strukturą reszty cukrowej obecnej w diosminie. Ponadto, niepublikowane dane sugerują, że diosmina wykazuje również aktywność przeciwwirusową przeciwko wirusowi dengi typu 2 (DENV-2) poprzez hamowanie glikoproteiny E wirusa DENV-2.

W przedstawionym badaniu oceniono skuteczność diosminu i innych wybranych flawonoidów jako środków przeciwwirusowych przeciwko IAV. Wykorzystując platformę dokowania molekularnego CB-Dock2, zidentyfikowano diosmin, fisetynę i orientinę jako trzy flawonoidy o najwyższym prawdopodobieństwie wiązania się z białkami wirusowymi H1N1. Diosmin wykazał najsilniejsze wiązanie z białkami wirusowymi NS1, HA i NA w porównaniu do innych flawonoidów podczas screeningu in silico. Wyniki te korelowały z badaniami in vitro, gdzie diosmin okazał się najsilniejszym inhibitorem replikacji IAV w komórkach A549 w porównaniu do fisetyny i orientiny.

Silne wiązanie diosminu do białek IAV podczas dokowania in silico może być wyjaśnione obecnością licznych grup hydroksylowych (OH) i tlenu (O) wbudowanych w jego strukturę aglikonu, ponieważ grupy te mają potencjał tworzenia wiązań wodorowych z resztami wirusowymi, tym samym zakłócając replikację wirusa. Dodatkowo, obecność składnika rutynozydu w diosminie prowadzi do zwiększenia liczby wiązań wodorowych i innych interakcji, potencjalnie wyjaśniając jego lepszą aktywność przeciwgrypową w porównaniu do orientiny.

Jakie są efekty przeciwwirusowe i bezpieczeństwo flawonoidów?

Badania cytotoksyczności wykazały, że wszystkie testowane flawonoidy nie wykazywały istotnej cytotoksyczności wobec komórek A549, nawet po 48 godzinach inkubacji w stężeniach do 5000 μM dla diosminu i 1000 μM dla fisetyny i orientiny. Wartości CC50 i MNTD diosminu wynosiły odpowiednio 11320,23 ± 2,29 μM i 1710,46 ± 2,11 μM, co było wyższe niż w przypadku orientiny i fisetyny. Na podstawie tych wyników wybrano standaryzowane najwyższe stężenie 25 μM dla diosminu, fisetyny i orientiny do pierwotnego screeningu przeciwwirusowego.

Wśród testowanych flawonoidów diosmin wykazał najwyższą aktywność hamującą, z wartością IC50 wynoszącą 2,91 ± 3,22 μM, a następnie orientina i fisetyna z wartościami IC50 odpowiednio 8,98 ± 2,03 μM i 142,60 ± 6,19 μM. Ekspozycja na diosmin w stężeniach 6,25, 12,5 i 25 μM prowadziła do zmniejszenia poziomu wirusowego RNA do mniej niż 20%, co było porównywalne z działaniem oseltamiwiru.

W celu głębszego zbadania konkretnych etapów replikacji IAV, na które wpływa diosmin, przeprowadzono test czasowo-dodawania. Wykazał on, że diosmin wykazuje właściwości przeciwwirusowe we wczesnych (0 godz. po infekcji) i późniejszych (2 godz. po infekcji) etapach replikacji wirusa, a także działanie profilaktyczne (-2 godz. po infekcji) przeciwko wirusowi. Odkryto, że diosmin indukuje ekspresję prawie wszystkich genów przeciwwirusowych, w tym IFITM-1, ISG15, ISG20, Mx-A, OAS-1 i SHFL, z wyjątkiem RSAD2. Znaczące zmiany w ekspresji zaobserwowano w ISG15 (6,774), SHFL (4,148), Mx-A (2,163) i OAS-1 (2,035), co wskazuje na ich istotną regulację w górę.

Jak diosmin modyfikuje odpowiedź gospodarza na infekcję?

Specyficzne testy przeciwwirusowe potwierdziły, że diosmin zakłóca etapy przyłączania i post-entry replikacji IAV. Diosmin wykazał najwyższą aktywność hamującą w fazie post-entry z wartościami IC50 wynoszącymi 12,17 ± 1,55 μM, a następnie w etapach przyłączania, wnikania i wirulicydowym z wartościami IC50 odpowiednio 13,35 ± 2,37 μM, 39,18 ± 0,63 μM i 41,27 ± 4,56 μM. Wyniki te podkreślają potencjał diosminu do skutecznego hamowania przyłączania wirusa i wywierania działania przeciwwirusowego głównie po wniknięciu wirusa do błony gospodarza, prawdopodobnie podczas transkrypcji mRNA wirusa, replikacji genomu i syntezy białek.

W celu wyjaśnienia mechanizmu działania diosminu przeprowadzono analizę proteomiczną wykorzystującą chromatografię cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Wyniki wykazały znaczne zmniejszenie wszystkich zidentyfikowanych białek IAV w zainfekowanych komórkach leczonych diosminem w porównaniu do kontroli wirusowej. HA, M1 i NP wykazały spadek o ponad dwukrotny (wartości log2FC odpowiednio -1,07, -1,32 i -1,45), podczas gdy NS1 wykazał najbardziej znaczący spadek, przekraczający czterokrotne zmniejszenie (log2FC = -2,76).

Analiza białek gospodarza wykazała, że białka dotknięte infekcją IAV i leczeniem diosminem prawdopodobnie odgrywają role w transdukcji sygnału, regulacji ekspresji genów i metabolizmie białek. Zidentyfikowano 37 znacząco różnicowo wyrażonych białek (DEP) potencjalnie związanych z hamowaniem replikacji wirusa grypy przez diosmin. Analiza interakcji białko-białko (PPI) została następnie opracowana w celu zaobserwowania wzajemnego oddziaływania między 37 DEP. Skonstruowana sieć PPI DEP składała się z 29 węzłów (DEP) i 87 krawędzi (interakcji), przy czym osiem białek zidentyfikowano jako pojedyncze węzły, które nie wchodzą w interakcje z żadnym z pozostałych DEP. Analiza ścieżek Reactome ujawniła, że DEP w sieci były związane ze ścieżkami wrodzonego układu odpornościowego.

Aby głębiej zbadać mechanizmy przeciw-IAV zapośredniczone przez diosmin poprzez wrodzony układ odpornościowy, przeprowadzono kompleksową analizę, mapując wszystkie białka w sieci klastrów do bazy danych InnateDB i zwiększając identyfikację interakcji w STRING/Cytoscape. Zidentyfikowano dziewięć DEP (UBE2N, MAP3K14, PSMA7, PSMC2, HSPB1, VCP, YWHAQ, YWHAH i GSTP1), które mają funkcjonalne interakcje z siecią składającą się z 20 białek wrodzonej odporności z InnateDB. Te białka interaktora są znane ze swoich ról w stymulowaniu produkcji interferonu typu I i regulacji szlaków przeciwzapalnych, co sugeruje, że dziewięć DEP działa głównie w tych samych szlakach we wrodzonej odporności.

Mechanizm przeciwwirusowy diosminu może obejmować zarówno ścieżki RLR, jak i TLR, ponieważ genom IAV może być obecny zarówno w cytoplazmie, jak i endosomie do rozpoznania wirusowego, które indukuje sygnalizację przeciwwirusową. Indukcja interferonu typu I jest ściśle związana z białkiem MAVS (mitochondrialne białko sygnalizacyjne przeciwwirusowe), które łączy mitochondria z przeciwwirusowymi sygnałami interferonu typu I. Receptory rozpoznawania patogenów (PRR) RIG-I i MDA5, które wykrywają ssRNA i dsRNA IAV w cytoplazmie, oddziałują z MAVS w sygnalizacji receptorów podobnych do genu I indukowalnego kwasem retinowym (RLR). Co więcej, ten potencjalny efekt przeciwwirusowy jest zrównoważony z efektem przeciwzapalnym, który chroni gospodarza przed uszkodzeniem przez układ odpornościowy.

Podsumowując, profilaktyczne i przeciwwirusowe działanie diosminu przeciwko wirusowi grypy typu A może być przypisane jego interakcjom ze składnikami wirusowymi, takimi jak NS1 i HA, wraz z jego wpływem na czynniki gospodarza poprzez regulację białek zaangażowanych w obronę gospodarza związaną z RLR i TLR oraz ścieżki przeciwzapalne. Wyniki te podkreślają znaczenie dalszych badań nad pełnym potencjałem diosminu jako środka terapeutycznego przeciwko wirusom grypy.

Podsumowanie

Badania nad wirusem grypy typu A (IAV) wykazały, że diosmina, naturalny flawonoid pochodzenia roślinnego, może stanowić skuteczną alternatywę dla obecnie stosowanych leków przeciwgrypowych. Diosmina wykazała najsilniejsze działanie przeciwwirusowe spośród badanych flawonoidów, z wartością IC50 wynoszącą 2,91 μM, co jest porównywalne z działaniem oseltamiwiru. Substancja ta charakteryzuje się wysokim profilem bezpieczeństwa i działa zarówno w fazie profilaktycznej, jak i terapeutycznej. Mechanizm działania diosminy polega na hamowaniu replikacji wirusa poprzez interakcję z kluczowymi białkami wirusowymi (NS1, HA) oraz stymulację odpowiedzi immunologicznej organizmu. Badania proteomiczne potwierdziły, że diosmina wpływa na ekspresję genów przeciwwirusowych i reguluje ścieżki odpowiedzi immunologicznej, w tym produkcję interferonu typu I. Wyniki badań sugerują, że diosmina może stanowić obiecującą opcję terapeutyczną w leczeniu infekcji wywołanych przez wirus grypy typu A.