Jak bakterie S. Typhimurium przekraczają bariery jelitowe?
Bakterie Salmonella Typhimurium stanowią poważne zagrożenie jako patogen jelitowy, powodujący zakażenia zarówno u ludzi, jak i zwierząt. Ich zdolność do przyczepiania się do komórek nabłonkowych jelita cienkiego i okrężnicy oraz wnikania do wnętrza tych komórek stanowi kluczowy element patogenezy. Bakterie te wykorzystują wyspecjalizowane komórki nabłonkowe, znane jako komórki M, jako wrota zakażenia, a następnie manipulują cytoszkieletem gospodarza za pomocą wydzielanych białek efektorowych. System wydzielniczy typu III (T3SS-1) odgrywa fundamentalną rolę w inwazji komórek nabłonkowych jelita, umożliwiając bakteriom wniknięcie i przetrwanie wewnątrz komórek gospodarza.
Bakterie S. Typhimurium wykorzystują dwie główne strategie wnikania do komórek: mechanizm “trigger”, polegający na manipulacji cytoszkieletem gospodarza, oraz zależny od receptorów mechanizm “zipper”. Po wniknięciu do komórki, bakterie chronią się w wyspecjalizowanych wakuolach, co pozwala im na uniknięcie mechanizmów obronnych gospodarza. Skuteczne leczenie takich zakażeń jest utrudnione ze względu na rosnącą oporność na antybiotyki oraz fakt, że niektóre antybiotyki nie są w stanie wyeliminować bakterii wewnątrzkomórkowych nawet przy zastosowaniu stężeń hamujących.
Skoordynowana ekspresja genów w obrębie wysp patogenności Salmonella (SPI-1 i SPI-2) jest kluczowa dla początkowej inwazji i późniejszego ustanowienia zakażenia. SPI-1 koduje białka systemu sekrecji typu III, które odgrywają kluczową rolę w wprowadzaniu cząsteczek efektorowych manipulujących strukturą cytoszkieletu gospodarza. Po wniknięciu do komórki, aktywowane są geny z SPI-2, kodujące kolejny system sekrecji, który przekierowuje transport endocytarny, zapobiegając fuzji lizosomów z wakuolami zawierającymi Salmonella.
- Wykorzystanie komórek M jako wrót zakażenia
- Dwa mechanizmy wnikania do komórek: “trigger” i “zipper”
- System wydzielniczy typu III (T3SS-1) umożliwiający inwazję komórek
- Wyspy patogenności (SPI-1 i SPI-2) kontrolujące proces inwazji i przetrwania
- Tworzenie specjalnych wakuoli chroniących przed mechanizmami obronnymi gospodarza
Czy Lon proteaza i systemy toksyna-antytoksyna sterują patogenezą?
Badacze zidentyfikowali Lon proteazę jako kluczowy czynnik w patogenezie S. Typhimurium. Ten dobrze zachowany w ewolucji enzym ATP-zależny odgrywa istotną rolę w fizjologii bakterii, przyczyniając się do degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek, regulacji ekspresji genów i modulacji odpowiedzi na stres. Lon proteaza może również degradować antytoksyny w systemach toksyna-antytoksyna, prowadząc do aktywacji tych systemów. Poprzez selektywną degradację uszkodzonych lub regulatorowych białek, Lon proteaza pomaga utrzymać homeostazę komórkową i umożliwia adaptację do zmiennych warunków środowiskowych.
Systemy toksyna-antytoksyna typu II dodają kolejną warstwę złożoności regulacyjnej do przeżywalności i wirulencji bakterii. Systemy te składają się ze stabilnej toksyny sparowanej z labilną antytoksyną, które wspólnie regulują los komórki w warunkach stresowych. W obliczu wyzwań środowiskowych, takich jak niedobór składników odżywczych czy stres oksydacyjny, antytoksyna może zostać zdegradowana przez proteazę Lon, pozwalając toksynie wywierać swoje działanie. Może to prowadzić do zatrzymania wzrostu lub programowanej śmierci komórki, potencjalnie służąc jako strategia przetrwania populacji bakteryjnej w warunkach stresowych.
Czy inhibitory Lon proteazy zmieniają dynamikę zakażeń?
W badaniu oceniano wpływ diosminy i nafcyliny – dwóch zidentyfikowanych wcześniej inhibitorów Lon proteazy – na przyleganie, inwazję i przeżywalność S. Typhimurium w różnych liniach komórkowych oraz w warunkach stresowych. Cytotoksyczność tych związków została zbadana na liniach komórkowych SW480 (rak jelita grubego), Hep2 (krtań) i RAW264.7 (makrofagi mysie). Wszystkie badane stężenia nafcyliny wykazały ponad 70% żywotności komórek, wskazując na brak działania cytotoksycznego. Natomiast diosmina wykazała pewną cytotoksyczność przy wyższych stężeniach (1024 μg/mL i 512 μg/mL) wobec komórek SW480 i Hep2, a szczególnie silną wobec komórek RAW264.7 przy 1024 μg/mL.
Badania adhezji bakterii do komórek gospodarza nie wykazały istotnego statystycznie zmniejszenia przylegania S. Typhimurium po inkubacji z badanymi inhibitorami. Obserwację tę potwierdzono przy użyciu barwienia metodą Giemsy, które wykazało, że liczba bakterii przylegających do komórek SW480, Hep2 i RAW264.7 w grupie leczonej nie różniła się znacząco od grupy kontrolnej.
Jednak w testach inwazji bakteryjnej zaobserwowano znaczące różnice. W komórkach RAW264.7 traktowanych 4 μg/mL nafcyliny odnotowano istotną redukcję liczby bakterii o 1,56 logarytmu po 2 godzinach inkubacji. Po 16 godzinach inkubacji w komórkach SW480 leczonych 8 μg/mL nafcyliny zaobserwowano znaczącą redukcję liczby bakterii o 2,08 logarytmu. W komórkach Hep2 zarówno diosmina (256 μg/mL) jak i nafcylina (4-8 μg/mL) spowodowały istotne zmniejszenie inwazji bakteryjnej, z redukcją odpowiednio o 1,25, 2,95 i 3,95 logarytmu.
Badano również wpływ inhibitorów Lon proteazy na przeżywalność S. Typhimurium w różnych warunkach stresowych. Podczas gdy leczenie diosminą i nafcyliną nie miało znaczącego wpływu na przeżywalność bakterii w warunkach stresu zimna, to w temperaturze 42°C podanie nafcyliny (8 i 4 μg/mL) spowodowało odpowiednio redukcję liczby bakterii o 3,08 i 2,3 logarytmu. W warunkach stresu osmotycznego zaobserwowano redukcję o 2,74 logarytmu przy zastosowaniu 8 μg/mL nafcyliny. W warunkach stresu kwasowego, zarówno nafcylina (8 i 4 μg/mL) jak i diosmina (256 i 128 μg/mL) znacząco obniżyły liczbę bakterii (redukcja odpowiednio o 2,88, 1,7, 2,36 i 1,4 logarytmu). Podobnie w warunkach stresu oksydacyjnego, oba inhibitory istotnie zmniejszyły przeżywalność bakterii, z redukcjami wynoszącymi 2,03 i 1,82 logarytmu dla nafcyliny (8 i 4 μg/mL) oraz 0,96 i 1,38 logarytmu dla diosminy (256 i 128 μg/mL).
- Nafcylina wykazuje lepszą skuteczność przy niższej cytotoksyczności (skuteczne stężenia: 4-8 μg/mL)
- Znacząca redukcja inwazji bakteryjnej w komórkach Hep2 (do 3,95 log)
- Szczególna skuteczność w warunkach stresu:
\- Temperatura 42°C: redukcja do 3,08 log
\- Stres kwasowy: redukcja do 2,88 log
\- Stres oksydacyjny: redukcja do 2,03 log - Potencjalne zastosowanie jako uzupełnienie konwencjonalnej antybiotykoterapii
Czy modulacja ekspresji genów otwiera nowe perspektywy leczenia?
Analiza ekspresji genów wykazała, że w S. Typhimurium infekującym różne linie komórkowe, system relE/relB wykazywał najwyższy wzrost ekspresji. W komórkach Hep2 wartości te wynosiły 21,4 i 43,4, w komórkach SW480 – 18,64 i 27,85, a w komórkach RAW264.7 – 30,46 i 41,43. W obecności diosminy i nafcyliny zaobserwowano zmniejszenie ekspresji wszystkich badanych genów w porównaniu do grupy nieleczonej. Interesujące jest to, że obecność inhibitorów zwiększała ekspresję genu hilA, kluczowego aktywatora wyspy patogenności SPI-1.
W warunkach stresowych zaobserwowano zwiększoną ekspresję genu lon proteazy we wszystkich czterech typach stresu: cieplnym, oksydacyjnym, osmotycznym i kwasowym. Najwyższy wzrost ekspresji genów gnat/rhh odnotowano w warunkach stresu cieplnego, z wartościami 3,21 i 8,1. W stresie osmotycznym większość badanych genów wykazała podwyższoną ekspresję, z genami gnat/rhh wykazującymi wzrost o 4,02 i 1,88. W stresie kwasowym tylko system parB/parE wykazał znaczący wzrost, z wartościami 2,18 i 4,14. W stresie oksydacyjnym nie zaobserwowano istotnego wzrostu ekspresji żadnego z analizowanych systemów. Leczenie diosminą i nafcyliną skutkowało zmniejszeniem ekspresji systemów toksyna-antytoksyna typu II.
Badania Kirthika i współpracowników wykazały, że delecja genu lon znacząco zwiększała zarówno adhezję, jak i inwazję do komórek gospodarza. Jednak przeżywalność wewnątrzkomórkowa szczepów z mutacją Lon była znacznie upośledzona w porównaniu do szczepów dzikich. W obecnym badaniu zaobserwowano zmniejszone przeżycie wewnątrzkomórkowe w komórkach nabłonkowych po 16 godzinach, podczas gdy w makrofagach przeżywalność była zmniejszona w ciągu pierwszych dwóch godzin. Wskazuje to, że wpływ proteazy Lon może różnić się w zależności od typu komórek.
Wyniki te wskazują, że Lon proteaza jest kluczowa dla przeżycia S. Typhimurium wewnątrz różnych komórek gospodarza oraz w odpowiedzi na stres oksydacyjny, kwasowy, osmotyczny i termiczny. Nafcylina i diosmina jako inhibitory Lon proteazy skutecznie zmniejszają przeżywalność wewnątrzkomórkową i żywotność bakterii, szczególnie w warunkach stresu kwasowego i oksydacyjnego. Sugeruje to ich potencjalne zastosowanie w łagodzeniu patogenezy i zakażeń systemowych związanych z S. Typhimurium.
Badania te otwierają nowe perspektywy dla strategii terapeutycznych skierowanych przeciwko bakteriom wewnątrzkomórkowym, które często są trudne do eliminacji za pomocą konwencjonalnych antybiotyków. Inhibitory Lon proteazy mogą stanowić cenne uzupełnienie arsenału terapeutycznego, szczególnie w przypadku szczepów opornych na wiele leków, gdzie tradycyjne podejścia terapeutyczne zawodzą.
Podsumowanie
\- S. Typhimurium wykorzystuje wyspecjalizowane mechanizmy do przekraczania barier jelitowych, w tym systemy sekrecji typu III.
\- Lon proteaza odgrywa kluczową rolę w patogenezie bakterii poprzez regulację systemów toksyna-antytoksyna.
\- Inhibitory Lon proteazy (diosmina i nafcylina) znacząco redukują inwazyjność i przeżywalność bakterii w różnych liniach komórkowych.
\- Największą skuteczność inhibitorów zaobserwowano w warunkach stresu kwasowego i oksydacyjnego.
\- Nafcylina wykazała się lepszą skutecznością niż diosmina, przy jednocześnie niższej cytotoksyczności.
\- Modulacja ekspresji genów przez inhibitory Lon proteazy może stanowić nową strategię terapeutyczną w leczeniu zakażeń S. Typhimurium.
Bibliografia
Narimisa Negar, Bostanghadiri Narjess, Khoshbayan Amin, Gharaghani Sajjad, Razavi Shabnam and Masjedian Jazi Faramarz. Impact of nafcillin and diosmin on the attachment, invasion, and stress survival of
